Uji Biokimia dan Identifikasi Mikroba- Laporan Praktikum Mikrobiologi Umum

 

 

PRAKTIKUM

Uji Biokimia dan Identifikasi Mikroba

 

       I.       Tujuan

1.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian hirolisis pati dan lemak

2.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian hidrolisis kasein

3.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian hidrolisis gelatin

4.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian H₂S dan motilitas

5.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian hidrolisis indol

6.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian reaksi susu litmus

7.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian fermentasi karbohidrat

8.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian TSI

9.      Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian MR-VP

10.  Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian sitrat

11.  Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian katalase

12.  Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian nitrit

13.  Mengetahui kemampuan enzimatik yang dimiliki oleh mikroorganisme berdasarkan hasil pengujian urea

14.  Menentukan morfologi bakteri  yang diidentifikasi

15.  Menentukan morfologi fungi  yang diidentifikasi

16.  Melakukan identifikasi genus dan spesies bakteri berdasarkan hasil pengamatan morfologi

17.  Melakukan identifikasi genus dan spesies bakteri berdasarkan uji biokimia

18.  Melakukan identifikasi genus dan spesies fungi berdasarkan hasil pengamatan morfologi

 

    II.            Latar Belakang

Karakteristik mikroorganisme dapat ditentukan dengan menggunakan mikroskop, pewarnaan mikroorganisme dilakukan agar mikroorganisme dapat diidentifikasi berdasarkan selnya karena pewarnaan memberikan informasi tentang morfologi bakteri reaksi gram, dan keberadaan dtruktur seperti kapsul dan endospora. Di luar itu, pengamatan mikroskopis hanya memberikan sedikit informasi tambahan mengenai genus dan spesies bakteri tertentu.

            Untuk mengidentifikasi bakteri, dapat digunakan uji biokimia karena reaksi biokimia yang dialami setiap organisme itu berbeda dan juga karena setiap spesies bakteri yang berbeda memiliki molekul DNA yang berbeda (DNA dengan rangkaian nukleotida yang unik). Metabolisme tidak lepas dari enzim. Secara umum, kita dapat mengklasifikasikan enzim sebagai exoenzim atau endoenzim. Eksoenzim disekresikan oleh bakteri ke lingkungan sekitarnya untuk memecah molekul nutrisi yang lebih besar sehingga dapat memasuki bakteri. Begitu berada di dalam organisme, beberapa nutrisi dipecah lebih lanjut untuk menghasilkan energi untuk menjalankan berbagai fungsi seluler, sementara yang lain digunakan untuk membentuk blok bangunan untuk sintesis komponen seluler. Reaksi selanjutnya ini dikatalisasi oleh endoenzim yang terletak di dalam bakteri.

            Dari uraian diatas, maka dilakukanlah praktikum yang berjudul uji biokimia dan identifikasi mikroba ini agar lebih memahami cara mengidentifikasi dan mengetahui morfologi serta memahami reaksi biokimia yang terjadi pada mikroba.

 

 

 

 III.            Tinjauan Pustaka

Uji biokimia yang menyelidiki aktivitas enzimatik sel adalah uji yang cocok dalam mengidentifikasi bakteri. Di laboratorium penelitian, seorang ahli mikrobiologi akan memulai dengan memeriksa morfologi sel, morfologi koloni, reaksi pewarnaan Gram, dan lingkungan tempat bakteri diisolasi. Uji biokimia adalah salah satu metode terpenting untuk identifikasi mikroba. Uji biokimia meliputi uji fermentasi karbohidrat, methyl red, pemanfaatan asam sitrat, dan produksi hidrogen sulfide. Uji biokimia mikroba mempersingkat waktu yang diperlukan untuk mengidentifikasi mikroba, mengurangi biaya, dan memastikan atau meningkatkan akurasi identifikasi sampel yang tidak diketahui. Ini adalah cara yang paling cepat berkembang dalam identifikasi mikroba.

Uji biokimia yang digunakan dalam identifikasi bakteri:

1.      Uji indol

Digunakan dalam identifikasi yang cepat. Jika hasil uji indol adalah negatif, maka tidak diperoleh lapisan cincin berwarna merah mudah pada permukaan media, artinya, tidak terjadi pembentukan indol dari triptofan oleh bakteri sebagai sumber karbon, dari penambahan kovaks

2.      Uji MR-VP

Tes ini digunakan untuk menentukan jalur fermentasi mana yang digunakan untuk memanfaatkan glukosa. Pada jalur fermentasi asam campuran, glukosa difermentasi dan menghasilkan beberapa asam organik (asam laktat, asetat, suksinat, dan format). Produksi asam yang cukup stabil untuk mengatasi buffer fosfat akan menghasilkan pH di bawah 4,4. Jika indikator pH (merah metil) ditambahkan ke alikuot kaldu kultur dan pH di bawah 4,4, warna merah akan muncul (gambar pertama, tabung di sebelah kiri). Jika MR berubah menjadi kuning, maka pH diatas 6,0 dan jalur fermentasi asam campuran belum dimanfaatkan (gambar pertama, tabung di sebelah kanan). Jalur fermentasi 2,3 butanediol akan memfermentasi glukosa dan menghasilkan 2,3 produk akhir butanediol sebagai pengganti asam organik. Untuk menguji jalur ini, sebuah alikuot dari kultur MR / VP dihilangkan dan a-naftol dan KOH ditambahkan. Mereka dikocok kuat-kuat dan didiamkan selama kurang lebih satu jam sampai hasilnya bisa terbaca. Tes Voges-Proskauer mendeteksi keberadaan acetoin, prekursor 2,3 butanediol. Jika kultur positif untuk asetoin, akan berubah menjadi "merah kecoklatan menjadi merah muda" (tabung di sebelah kiri pada gambar kedua). Jika kultur negatif untuk asetoin, itu akan berubah menjadi "hijau kecoklatan menjadi kuning" (tabung di sebelah kiri pada gambar kedua). Catatan: Suatu kultur biasanya hanya akan positif untuk satu jalur: baik MR + atau VP +. Escherichia coli adalah MR + dan VP-. Sebaliknya, Enterobacter aerogenes dan Klebsiella pneumoniae adalah MR- dan VP +. Pseudomonas aeruginosa adalah glukosa nonfermenter dan karenanya MR- dan VP-.

3.      Uji katalase

pengujiannya digunakan untuk mengidentifikasi organisme yang menghasilkan enzim, katalase. Enzim ini mendetoksifikasi hidrogen peroksida dengan memecahnya menjadi air dan gas oksigen.

2H₂O₂ à 2H₂O + O₂

Gelembung yang dihasilkan dari produksi gas oksigen dengan jelas menunjukkan hasil katalase positif. Sampel di kanan bawah adalah katalase positif. Staphylococcus spp. dan Micrococcus spp. adalah katalase positif. Streptococcus dan Enterococcus spp. adalah katalase negatif.

4.      Uji sitrat

Media yang digunakan adalah simons sitrat. Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya.media cimons sitrat mengandung indicator BTB dimana ketika asam sitrat digunakan bakteri sebagai sumber karbon, maka media akan berubah menjadi basa dan warnanya menjadi biru.jika hasil uji positif menunjukkan terjadinya perubahan warna pada media yang semula berwarna hijau menjadi biru, yang berarti bakteri sebagai sumber karbon (Ratna, 2012)

5.      Uji gelatin

Terdapat enzim-enzim yang dapat menguraikan golongan protein yang disebut sebagai protease. Larutan gelatin berbentuk cair pada suhu kamar dan akan berbentuk padat jika diletakkan di refrigenator dan jika sudah dihidrolisis oleh bakteri, gelatin akan tetap berbentuk cair. (Hadioetomo, 1993)

6.      Uji urea/urease

Tes ini digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang mampu menghidrolisis urea menggunakan enzim urease. Biasanya digunakan untuk membedakan genus Proteus dari bakteri enterik lainnya. Hidrolisis urea membentuk basa lemah yaitu amonia sebagai salah satu produknya. Basa lemah ini menaikkan pH media di atas 8,4 dan indikator pH, merah fenol, berubah dari kuning menjadi merah muda. Proteus mirabilis adalah hidrolisis cepat urea (tabung tengah digambarkan di sini). Tabung di paling kanan diinokulasi dengan organisme negatif urease dan tabung paling kiri tidak diinokulasi.

7.      Uji TSIA

Digunakan untuk membedakan genus bakteri, perbedaan tersebut didasarkan atas perbedaan dalam fermentasi karbohidrat dan produksi hydrogen sulfide oleh bakteri

8.      Hidrolisis pati

Jika pati dihidrolisis oleh bakteri akan menghasilkan dekstrin. Hidrolisis terjadi karena bantuan enzim amylase yang dihasilkan oleh organisme tertentu. Hasil uji ini adalah akan berwarna biru jika masih terdapat butir-butir pati, dan akan berwarna bening jika pati sudah terhidrolisis sempurna.

9.      Hidrolisis lemak

Menguraikan molekul lemak menjadi gliserol dan asam lemak kemudian asam lemak dibentuk menjadi energi. Terbentuknya butiran berwarna hijau disekitar koloni menandakan hasil uji yang positif.

10.  Hidrolisis kasein

Jika mikroba dapat menghidrolisis protein ini, maka akan terlihat zona bening disekitar koloni.

11.  Fermentasi karbohidrat

Merupakan proses fermentasi karbohidrat terjadi pada kondisi anaerob. Jika hasil uji positif, maka akan terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi berwarna kuning. Perubahan warna terjadi akibat kondisi aerob yang menyebabkan penurunan pH pada media.

12.  Uji H₂S dan motilitas

Adanya H₂S ditandai dengan terbentuknya sulfide berwarna hitam. Uji ini biasa digunakan untuk mengidentifikasi bakteri golongan enterobacter. Motilitas ditandai dengan gerak pertumbuhan dalam agar tegak.

13.  Uji Nitrat

Ini adalah media diferensial. Ini digunakan untuk menentukan apakah suatu organisme mampu mereduksi nitrat (NO3-) menjadi nitrit (NO2-) atau senyawa nitrogen lainnya melalui aksi enzim nitratase (juga disebut nitrat reduktase). Tes ini penting untuk mengidentifikasi spesies Gram-positif dan Gram-negatif.

Setelah inkubasi, tabung ini pertama kali diperiksa untuk mengetahui keberadaan gas di tabung Durham. Dalam kasus nonfermenter, ini merupakan indikasi reduksi nitrat menjadi gas nitrogen. Namun, dalam banyak kasus, gas dihasilkan melalui fermentasi dan pengujian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apakah telah terjadi reduksi nitrat. Pengujian lebih lanjut ini mencakup penambahan asam sulfanilik (sering disebut nitrat I) dan dimetil-alfa-napthalamin (nitrat II). Jika nitrit terdapat di dalam media, maka akan bereaksi dengan nitrat I dan nitrat II membentuk senyawa merah. Ini dianggap sebagai hasil yang positif. Jika tidak ada warna merah yang terbentuk setelah penambahan nitrat I dan II, ini menunjukkan bahwa NO3- belum diubah menjadi NO2- (hasil negatif), atau NO3- diubah menjadi NO2- dan kemudian segera direduksi menjadi yang lain, bentuk nitrogen yang tidak terdeteksi (juga merupakan hasil positif). Untuk menentukan yang mana dari kasus sebelumnya, unsur seng ditambahkan ke kaldu. Seng akan mengubah sisa NO3- menjadi NO2- sehingga memungkinkan nitrat I dan nitrat II bereaksi dengan NO2- dan membentuk pigmen merah (hasil negatif yang diverifikasi). Jika tidak ada perubahan warna yang terjadi pada penambahan seng maka ini berarti bahwa NO3- diubah menjadi NO2- dan kemudian diubah menjadi bentuk nitrogen lain yang tidak terdeteksi (hasil positif).

Jika kaldu nitrat berubah menjadi merah (tabung digambarkan di tengah) setelah nitrat I dan nitrat II ditambahkan, warna ini menunjukkan hasil positif. Jika sebaliknya, tabung berubah menjadi merah (tabung digambarkan di sebelah kiri) setelah penambahan Zn, ini menunjukkan hasil negatif. Jika tidak ada perubahan warna pada tabung setelah penambahan nitrat I dan nitrat II, hasilnya tidak pasti. Jika tabung tidak berwarna (gambar di sebelah kanan) setelah penambahan Zn ini menunjukkan hasil yang positif.

14.  Reaksi susu litmus

Digunakan untuk melihat kemampuan bakteri dalam menggunakan komponen yang ada pada susu. Media yang digunakan adalah litmus dan juga susu. Reaksi yang dapat terjadi pada uji ini adalah fermentasi laktosa, produksi gas, reduksi litmus, dan reaksi alkalin.

            Metode yang digunakan dalam pengamatan morfologi mikroba adalah:

1.      Pewarnaan gram

Digunakan untuk mengetahui kelompok kelompok bakteri gram positif dan gram negative. Jika ketika ditambahkan KOH koloni berbentuk benang elastis maka bakteri itu adalah bakteri gram positif, begitu juga sebalikya. Pengujian gram menggunakan KOH berdasar pada penghancuran lipid oleh KOH dimana bakteri gram negative mempunyai lapisan lipid bilayer , dan dinding sel nya tersusun atas lipoprotein yang akan dihancurkan dengan meneteskan KOH yang menyebabkan DNA keluar sel.

2.      Pewarnaan endospore

Pewarnaan endospora adalah pewarnaan diferensial yang digunakan untuk memvisualisasikan endospora bakteri. Endospora dibentuk oleh beberapa bakteri, seperti Bacillus. Dengan membentuk spora, bakteri dapat bertahan hidup dalam kondisi yang tidak bersahabat. Spora tahan terhadap panas, desikasi, bahan kimia, dan radiasi.

3.      Pengamatan mikroskopis morfologi jamur

Jamur memiliki karakteristik utama yaitueukariotik yang menggunakan spora sebagai alat untuk berkembangbiak. Struktur tubuh jamur yang umum adalah filament multiseluler dan sel tunggal berupa ragi, dimana ragi biasa tumbuh di tempat yang mengandung nutrisi seperti gula dan asam amino (Campbell et al., 2009).

 

 

  IV.            Bahan dan Alat

4.1. Bahan

 

No	Bahan
1	Akuades
2	NA
3	Lemak
4	CuSO4
5	Kasein
6	Gelatin
7	Kaldu tripton 1%
8	Larutan kovac
9	Kaldu sukrosa
10	Glukosa
11	Laktosa
12	Agar TSI
13	MRVP
14	Methyl red
15	KOH
16
17	Agar sitrat simon
18	Nitrat
20	Urea

 

4.2.Alat

No	Alat
1	Erlenmeyer
2	Bunsen
3	Gelas ukur
4	Pipet ukur
5	Neraca analitik
6	Batang pengaduk
7	Tabung reaksi
8	Rak tabung
9	Autoklaf
10	Jarum inokulator

 

  VI.Hasil Pengamatan

1	Uji Hidrolisis Pati
	Control positif A	Control positif B
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel A Medium : agar pati Reagen : iodin Keterangan : terjadi perubahan warna medium menjadi kembali ke medium awal (+)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : agar pati Reagen : iodin Keterangan : terjadi perubahan warna medium menjadi biru kehitaman (-)
2	Uji Hirdrolisis Lemak
	Control positif A	Control positif B
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel A Medium : agar lemak/ medium tributirin Reagen : CuSO4 Keterangan : terjadi perubahan warna menjadi biru kehijauan (+)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamata n : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : agar lemak/ medium tributirin Reagen : CuSO4 Keterangan : terjadi perubahan warna menjadi biru kehijauan (+)

                                                                                                                                                                     

 

3	Uji Hidrolisis Kasein
	Control positif C	Control positif D
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel C Medium : agar susu Reagen : - Keterangan : tidak adanya zona bening pada medium	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel D Medium : agar susu Reagen : - Keterangan : tidak adanya zona bening pada medium
4	Uji Hirdrolisis Gelatin
	Control positif A	Control positif B
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel A Medium : agar gelatin Reagen : - Keterangan : terjadi cair pada medium agar gelatin (-)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : agar gelatin Reagen : - Keterangan : terjadi padatan pada medium agar gelatin (+)

 

 

 

 

.	Uji Motilitas/H2S
	Control positif A	Control positif B
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel A Medium : SIM Agar Reagen : - Keterangan : (-) karena tidak ada pergerakan bakteri	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : SIM Agar Reagen : - Keterangan : (-) karena tidak ada pergerakan bakteri

                                                                                                                                                          

6.	Uji Fermentasi Glukosa
	Control positif A	Control positif C
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel A Medium : kaldu glukosa Reagen : - Keterangan : tidak terdapat gelembung pada tabung durham, medium berwarna kuning (-)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel C Medium : kaldu glukosa Reagen : - Keterangan : terdapat gelembung pada tabung durham, medium berwarna kuning (+)

 

 

 

 

 

7	Uji Fermentasi Sukrosa
	Control positif B	Control positif D
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : kaldu sukrosa Reagen : - Keterangan : terdapat gelembung pada tabung durham, medium berwarna kuning (+)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel D Medium : kaldu sukrosa Reagen : - Keterangan : terdapat gelembung pada tabung durham, medium berwarna kuning (+)
8	Uji Fermentasi Laktosa
	Control positif C	Control positif D
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel C Medium : kaldu laktosa Reagen : - Keterangan : terdapat gelembung pada tabung durham, medium berwarna kuning (+)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel D Medium : kaldu laktosa Reagen : - Keterangan : terdapat gelembung pada tabung durham, medium berwarna kuning (+)

 

 

 

 

9	Uji TSI
	Control positif B	Control positif E
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium :  agar TSI miring Reagen : phenol red Keterangan : terjadi perubahan warna dari kehitaman ke merah (+)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel E Medium :  agar TSI miring Reagen : phenol red Keterangan : tidak terjadi perubahan warna dari kehitaman ke merah (-)
10	Uji Methyl Red dan Voges Proskauer (MRVP)
	Control positif A	Control positif B
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel A Medium : kaldu MRVP Reagen :  α-napthol Keterangan : terjadi perubahan warna dari warna merah ke warna pink (+)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : kaldu MRVP Reagen :  α-napthol Keterangan : tidak terjadi perubahan warna dari warna merah ke warna pink (-)

 

 

 

 

 

11	Uji Sitrat Simon
	Control positif B	Control positif D
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : agar sitrat simon miring Reagen : bromthymol blue Keterangan : tidak terjadi perubahan warna dari hijau ke warna biru (-)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel D Medium : agar sitrat simon miring Reagen : bromthymol blue Keterangan : terjadi perubahan warna dari hijau ke warna biru (+)

 

12	Uji Katalase
	Control positif A	Control positif C
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel A Medium : NA miring Reagen : H2O2 3% Keterangan : tidak terjadi adanya gelembung pada medium tersebut (-)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel C Medium : NA miring Reagen : H2O2 3% Keterangan : tidak terjadi adanya gelembung pada medium tersebut (-)

 

 

 

 

 

13	Uji Nitrat
	Control positif B	Control positif D
	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel B Medium : kaldu nitrat Reagen : asam sulfanilat dan α-napthtylamine Keterangan : tidak terjadi perubahan warna menjadi warna merah (-)	Tgl praktikum : 15 Oktober 2020 Tgl pengamatan : 15 Oktober 2020 Kultur/Sampel : sampel D Medium : kaldu nitrat Reagen : asam sulfanilat dan α-napthtylamine Keterangan : tidak terjadi perubahan warna menjadi warna merah (-)

 

 

VIII.            Data Pengamatan

IX.            No	Uji		Medium	Sampel	Inkubasi 24 jam	Inkubasi 48 jam
1	Hidrolisis Pati		Agar Pati	A	+	+
				B	-	-
2	Hidrolisis Lemak		Agar Lemak	A	+	+
				B	+	+
m3	Hidrolisis Protein	Kasein	Agar Kasein	C	-	-
				D	-	-
		Gelatin	Gelatin	A	-	-
				B	+	+
4	Produksi Indol		Kaldu Triptofan	-	-	-
5	Uji Motilitas /H2S		SIM Agar	A	-	-
				B	+	+
6	Reaksi Susu Litmus		Susu Litmus Broth	-	-	-
				-	-	-
				-	-	-
				-	-	-
7	Fermentasi Karbohidrat	Glukosa	Kaldu Glukosa	A	-	-
				C	+	+
		Laktosa	Kaldu Laktosa	C	+	+
				D	+ ++	+
		Sukrosa	Kaldu Sukrosa	B	+	+
				D	+	+
8	Uji TSI		Agar TSI	B	+	+
				E	-	-
9	Uji MR-VP	MR	Kaldu MRVP	A	+	+
		VP	Kaldu MRVP	B	-	-
10	Sitrat Simon		Agar Sitrat Simon	B	-	-
				D	+	+
11	Uji Katalase		NA Miring	A	-	-
				C	-	-
12	Uji Urease		Kaldu Urea	-	-	-
13	Uji Nitrat		Kaldu Nitrat	B	-	-
				D	-	-

 

     X.            Pembahasan

pada praktikum ini dilakukan pemngamatan aktivitas biokimia/ metabolisme mikroorganisme untuk menguraikan molekul yang kompleks menjadi molekul yang lebih sederhana. Maka akan dibahas setiap uji menurut hasil yang diperoleh:

1.      Hidrolisis pati

Pati merupakan polisakarida dari glukosa sederhana. Beberapa bakteri mampu menggunakan pati sebagai sumber karbohidrat, namun pati tidak dapat digunakan mikroba secra langsung sehingga harus dihidrolisis menjadi gula yang lebih sederhana sehingga dapat masuk ke sel. Bakteri  akan mengeluarkan enzim amilase yang dapat menghidrolisis pati sehingga akan memecahkan ikatan antar molekul glukosa. Hasil hidrolisis ini dapat dideteksi menggunakan lugol.

Prinsip kerja uji ini adalah reaksi antara amilum dan iodin sehingga menghasilkan zona bening di sekitar koloni. Jika hasil uji positif maka akan tampak zona bening disekitar medium pati yang ditetesi larutan lugol/iodium karena pati berhasil dihidrolisis.

            Pada percobaan ini, digunakan 2 kultur bakteri yaitu Escherichia coli dimana medium menjadi berwarna biru. Berdasarkan litelatur, koloni yang ditetesi ioduim dan warna medium menjadi bening menunjukkan pati terhidrolisis sempurna. Dan warna koloni biru menunjukkan pati tidak terhirolisis, dan jika medium berwarna coklat artinya pati terhidrolisis sebagian.

2.      Hidrolisis lemak

Hidrolisis lemak dilakukan untuk memecah lemak menjadi asam lemak dan gliserol. hidrolisis lemak menggunakan reagen CuSO4. Hasil uji positif ditandai dengan timbulnya bau tengik dan terjadi perubahan ph yang menyebabkan ph substrat menjadi rendah karena terbentuknya asam lemak.

Pada percobaan ini digunakan B.subtilis dan E.coli dan hasil yang diperoleh adalah berwarna biru. Jadi dapat disimpulkan bahwa bakteri B.subtilis dan E.coli dapat menghidrolisis lemak.

Berdasarkan literatur, bakteri yang dapat menghidrolisis lemak adalah bakteri yang mampu mengubah senyawa lemak menjadi asam lemak dan gliserol dimana bakteri ini memiliki enzim lipase yang aktif oleh panas sehingga reaksi yang terjadi adalah:

3.      Uji kasein

Prinsip dari uji ini adalah mendeteksi adanya pembentukan asam oleh bakteri yang disebabkan oleh aktivitas bakteri yang bersifat mesofilik. Bakteri ini akan memecah laktosa menjadi asam laktat. Kerja enzim protiolitik akan memecah protein dan merusak stabilitas kasein itu. Hasil positif pada uji ini akan menunjukkan zona bening di sekitar koloni

Berdasarkan literature, uji kasein dilakukan untuk mengetahui adanya pembentukan asam oleh bakteri. Kasein pada susu kasein berwarna hitam. Jika bakteri mampu memecah kasein maka media akan menjadi bening. Contoh bakteri yang mampu membentuk asam yaitu B.subtilis dan E.coli..

4.      Hidrolisis gelatin

Prinsip dari uji ini adalah mendeteksi kemampuan mikroba dalam membentuk enzim proteolitik yang dapat mencairkan gelatin. Hasil positif pada uji ini adalah gelatin yang didinginkan akan tetap berbentuk cair. Artinya reaksi bersifat irreversible. Enzim yang bekerja adalah proteolysis sehingga ikatan hidrogennya diputuskan pada reaksi tersebut.

Gelatin (polipeptida) à Asam amino  (dengan bantuan enzim gelatinase)

Berdasarkan literatur, hasil negative diberikan jika gelatin tetap padat. Bakteri yang mampu membentuk enzim proteolitik adalah E.coli dan yang tidak dapat membentuk enzim proteolitik adalah bakteri B.subtilis.

Pada paktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil yaitu medium yang awalnya padat menjadi cair . jadi dapat disimpulkan bahwa bakteri Enterococcus faecalis yang diuji dapat menghidrolisis gelatin.

5.      Produksi indol

Prinsip uji indol adalah mengidentifikasi apakah bakteri yang diuji memiliki enzim triptofanase yang akan mengoksidasi asam amino yaitu triptofan dan membentuk indol. Triptofan memiliki gugus samping aromatic. Keberadaan indol dapat diketahui dengan penambahan reagen kovac yang terkandung pada dimetil asam amino benzaldehid. Hasil positif ditandai dengan terdapat lapisan cincin berwarna merah pada permukaan media, artinya bakteri membentuk indol dari triptofan sebagai sumber karbon. Sedangkan uji negative ditandai dengan tidak terbentuknya lapisan cincin berwara meah.

Rekasi produksi indol tahap 1

rekasi tahap 2

Dari percobaan yang dilakukan digunakan bakteri E.coli dan Enterococcus faecalis diperoeh hasil yaitu terdapat lapissan cincin berwarna merah jadi dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diuji pada saat praktikum dapat memproduksi indol.

 

6.      Uji H2S dan Motilitas

     Prinsip uji adalah mengidentifiksi bakteri dengan kemampuan menghidrolisis asam amino yaitu sistein sehingga dihasilkan sulfur dengan adanya hidrogen dari air.Selain itu,H2S dapat diproduksi dari reduksi senyawa anorganikyang mengandung sulfur seperti sulfit,atau trosullfat.

     Medium SIM agar ,yang telah ditambahkan senyawa anorganik yang mengandung sulfur yaitu natrium trosulfat.Senyawa ini akan bereaksi dengan ion hidrogen dari air dan dengan adanya enzim trosulfat reduktase ,yang akan dihasilkan ion sulfit dan H2S berupa gas.Hasil positif akan menunjukkan warna hitam pada medium.Berdasarkan literatur,gas hidrogen sulfida dapat timbul sebagai hasilpenguraian protein dan senyawa yang mengandung belerang.Bakteri yang menghasilkan gas ini adalah Desultrovibrio desulfuricans (Dwidsoseputro,1980).Berdasarkan praktikum yang telah kami lakukan dengan kultur bakteriEnterococcus faecalis dan E.coli idisimpulkan bahwa hasil positif dan sesuai dengan literature.

7.      Fermentasi Karbohidrat

            Prinsip uji ini adalah mengidentifikasi apakah bakteri mampu menghasilkan asam dalam reaksi anaerob.Hasil positif dari uji ini adalah perubahan warna menjadi kuning dan terdapat gas dimana akan dihasilkan asam/alkohol dan gas CO2 .Sedangkan hasil negatif yaitu berwarna putih keruh.Berdasarkan praktikum yang kami lakukan didapatkan hasil yaitu

a)Fermentasi Glukosa dengan bakteri Escherichia coli dan Enterococcus faecalis didapatkan hasil yaitu terjadi perubahan merah menjadi kuning pucat dan terdapat gas artinya bakteri tersebut mampu melakukan fermentasi glukosa,sehingga didapat hasil positif

b)Fermentasi Sukrosa dengan bakteri Escherichia coli dan Enterococcus faecalis didapatkan hasil yaitu terjadi perubahan warna merah menjadi kuning pucat dan terdapat gas artinya bakteri tersebut mampu melakukan fermentasi sukrosa ,sehingga didapat hasil positif.

c) Fermentasi Laktosa dengan bakteri Escherichia coli dan Enterococcus faecalis didapatkan hasil yaitu terjadi perubahan warna merah menjadi kuning pucat dan terdapat gas artinya bakteri tersebut mampu melakukan fermentasi laktosa ,sehingga didapat hasil positif.

Jadi, dapat kami simpulkan bahwa bakteri yang kami uji dapat melakukan fermentasi karbohidrat.

 

8.      Uji TSI

            Prinsip uji ini adalah mengidentivikasi apakah bakteri ini mampu memfermentasikan gula-gula dan kemampuan bakteriuntuk menghasilkan gas dan H2S dari proses fermentasi tersebut pada TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika bakteri mampu memfermentasikan kedua asam amino ini maka gugus S akan lepas dan berikatan dengan H2 pada H2O dan oksigen akan lepas.Hasil positif yang akan terjadi adalahperubahan warna merah menjadi kuning dari terbentuknya gas H2S.Berdasarkan praktikum yang kami lakukan di dapatkan hasil yaitu perubahan warna menjadi merah yang menandakan mediumbasa.

Gkukosa, laktosa,sukrosa        glikolisis             piruvat + CO₂

9.      Uji Methyl red dan Voges Proskaver

          Prinsip uji methyl red adalah metil merah sebagai reagen untuk menghasilkan asam organik melalui proses hidrolisis.Methyl red akan menjadi merah pada suasana asam (lingkungan dengan PH 4,4) sebagai hasil positif dan akan berwarna kuning pada suasana basa(lingkungan dengan PH 7,6,2)sebagai hasil negatif.Berdasarkan literatur yang kami dapat, bahwa jenis bakteri yang menempati saluran pencernaan seperti pada golongam coliform dan entrobacteriaceae adalah jenis bakteri yang dapat digunakan untuk pengidentivikasi metode ini.

          Prinsip uji voges-proskaver adalah mengidentiviksi mikroorganisme yang melakukan vermentasi dengan produk yaitu 2,3 butanadial.Bila bakteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadial sebagai produk utama akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam meata pertumbuhan.Penambahan  KOH dan α-nopthol digunakan untuk menentukan adanya asetil metil karbinol(asetoin),suatu senyawa intermeohet dalam sintetis 2,3 butanol.Uji ini sebenarnya merupakan uji tidak langsung karena produknya belum terbentuk.Jika hasil positif terjadi perubahan warna media menjadi merah yang artinya hasil akhir fermentasi bakteri adalah asetoin(colome,2001).Berdasarkan praktikum yang kami lakukan didapatkan hasil pada uji MRUP dengan kultur Enterococcus faecalis medium menghasilkan warna merah muda bening(pink).Jadi dapat disimpulkan bahwa bakteri yang kami uji dapat menghidrolisis menghasilkan asam organik dan mampu memfermentasikan glukosa menjadi asetoin.

10.  Uji Katalase

Prinsip uji ini adalah menentukan jenis bakteri dengan mengetahui ada tidaknya enzim katalase pada bakteri tersebut.Pengujian ini menggunakan H2O2 3% karena H2O2 merupakan salah satu hasil respirasi aerobik bakteri dimana hasil respirasi dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena sifat toksik nya sehingga komponen ini harus dipecah lagi dengan enzim katalase.Reaksi yang terjadi sebagai berikut:

>H20+ O2

Berdasarkan praktikum yang kami lakukan didapatkan hasil yaitu timbulnya gelembung gas pada tabung reaksi.Yang menendakan bahwa gelembung tersebut merupakan gas oksigen dimana hasil positif.Jadi dapat disimpilkan bahwa bakteri yang kami uji (Enterococcus faecalis dan Bacillus subeilis) mempunyai enzim katalase sehingga dapat memecah H2O2 menjadi air dan oksigen

11.  Uji Urease

Prinsip uji ini adalah mengidentifikasi apakah mikroba (bakteri)memiliki enzim urease yang dapat menguraikan Urea membentuk amonia.Media urea berisi indikator fenol red.hasil positif,terjadi perubahan warna menjadi merah menyala artinya bakteri memecah urea menjadi amonia,sedangkan hasil negatif terjadi tidak adanya perubahan warna pada medium (Lim,2006).Berdasarkan praktikum yang kami lakukan didapatkan hasil yaitu terjadi perubahan warna medium menjadi merah pada bakteri Enterococcus faecalis artinya bakteri dapat memecah urea menjadi amonia sebagai hasil positif.

12.  Uji Nitrat

            Prinsip uji ini adalah mengidentifikasi bakteri antara reaksi nitrit dengan asam sufanilat dan α-naftilamin sehingga mengetahui apakah bakteri memiliki enzim nitrat reduktase.Dimana reaksi yang terjadi adalah:

Berdasarkan praktikum yang kami lakukan didapatkan hasil yaitu terjadi perubahan warna medium menjadi merah oleh bakteri Enterococcus faecalis dan Escherichia coli .

13 Uji Sitrat Simon                                                                                             

     Uji ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi :bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat maka asam akan dihilangkan dari medium biakan,sehingga menyebabkan peningkatan PH dan mengubah warba medium dari hijau ke biru.      

     Pada praktikum yang kami lakukan didapatkan hasil yaitu terjadi perubahan medium dari hijau menjadi biru denga bakteri Enterococcus faecalis dan Escherichia coli berarti mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu satunya summber karbon.

 

  XI.            Kesimpulan

 

1.      Hidrolisis pati terjadi karena adanya enzim amilase yang dihasilkan oleh mikroba yang hasil positifnya ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar medium pati yang ditetesi iodin sebagai reagen yang berarti bakteri berhasil menghidrolisis pati.

2.      Hidrolisis lemak terjadi karena adanya enzim lipase dimana hasil positifnya adalah tercium aroma tengik dan medium berubah warna menjadi biru yang berarti bakteri telah berhasil menghidrolisis lemak

3.      Uji kasein terjadi akibat adanya aktivitas enzim protiolitik yang hasil positifnya ditunjukka dengan terbentuknya gas dalam medium dan larutan menjadi berwarna bening.

4.      Hidrolisis gelatin membentuk enzim proteolitik yang dapat mencairkan gelatin sehingga ikatan hidrogennya telah diputuskan pada reaksi tersebut

5.      Produksi indol terjadi akibat adanya enzim triptofanase yang hasil positif nya ditandai dengan adanya lapisan cincin merah pada permukaan medium yang berarti bakteri berhasil membentuk indol dari triptofan sebagai sumber karbon

6.      Uji H₂S dan motilitas terjadi akibat adanya kemampuan bakteri dalam menghidrolisis asam amino yaitu sistein yang hasil positifnya akan menunjukkan warna hitam pada media

7.      Fermentasi karbohidrat terjadi karena adanya kemampuan bakteri dalam menghasilkan asam dalam kondisi anaerob yang hasil positifnya ditunjukkan dengan adanya perubhan warna medium dari merah menjadi kuning.

8.      Uji TSI terjadi karena adanya kemamfuan bakteri dalam memfermentasikan gula-gula dan menghasilkan gas dan H₂S dari proses fermentasi.

9.      Uji MR terjadi karena adanya kemampuan bakteri dalam menghasilkan asam organik dalam proses hidrolisis, sedangkan MV kemampuan dalam menghasilkan produk 2,3 butanadiol.

10.  Uji katalase terjadi akibat adanya enzim katalase sehingga dapat memecah H2O2 menjadi air dan oksigen. Hasil positifnya terbentuk gelembung atau udara pada media

11.  Uji urease terjadi akibat adanya enzim urease yang mampu menguraikan urea membentuk ammonia. Hasil positifnya ditunjukkan dengan perubahan warna medium menjadi merah.

12.  Uji nitrat terjadi akibat adanya enzim nitrat reduktase yang hasil positifnya terjadi perubahan warna medium menjadi merah

13.  Uji sitrat simon menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energinya sehingga menyebabkan peningkatan PH dan perubahan waarna medium dari hijau menjadi biru sebagai hasil positif